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5 Ergebnisse

5.7 Die Gene sdmA, sdmB und sdmC liegen auf einem

gemeinsamen polycistronischen Messenger

In der vorangegangenen Northern-Blot-Analyse wurde die Größe des mit Sonde I

identifizierten Transkripts auf ca. 3000 – 4000 Nukleotiden geschätzt. Der

eigentliche Messenger wäre demnach deutlich länger, als das Gen sdmA mit 672 bp.

Ein möglicher Transkriptionsstartpunkt wurde im 5´-Bereich nicht sehr weit entfernt

vom Translationsstart des Gens sdmA kartiert. Es lag daher die Vermutung nahe,

dass die Gene sdmB und sdmC gemeinsam mit sdmA auf einem polycistronischen

Messenger liegen. Deshalb wurde eine Northern-Blot-Analyse, außer mit der

Sonde I, auch mit den Sonden II, III und IIIdown durchgeführt. Die Sonde II bindet an

sdmB, Sonde III an sdmC und die Sonde IIIdown an das Gen, welches stromabwärts

von sdmC liegt. Sie sollte zeigen, ob sich noch ein weiteres Gen auf dem

gemeinsamen Messenger befindet. Die Bindestellen der Sonden sind schematisch

im oberen Teil der Abb. 12 dargestellt. Die Fragmente für die radioaktiven

Zufallsmarkierungen wurden mittels einer PCR gewonnen. Für die Sonde II wurden

die Oligonukleotide metI2Hfw und metIHr, für die Sonde III die Oligonukleotide

RTmetIIfe und metII2Hrv und für die Sonde IIIdown die Oligonukleotide metIIIfw und

metIIIrv verwendet. Die Herstellung der Sonde I ist in 5.2 beschrieben. Die

Hybridisierungstemperatur betrug bei den Sonden I, II, und III 55°C, bei der Sonde

IIIdown 50°C.

Nach der Hybridisierung einer Membran mit Sonde II oder III (Abb. 12B oder D,

Spur 1) wurde in einer Autoradiographie jeweils ein Signal in der gleichen Größe wie

mit Sonde I (Abb. 12A, Spur 1) vorgefunden. Die Länge der Transkripte wurde auf je

3 500 Nukleotide geschätzt. Sie ließen sich nur in Gesamt-RNA aus selenarmen

Kulturen, nicht aber in Gesamt-RNA aus selenhaltigen Kulturen nachweisen. Die

verkürzten Fragmente sind vermutlich Abbauprodukte der vollständigen Messenger.

Die Qualität der RNA wurde durch das Färben der Membranen mit Methylenblau

überprüft. Die Banden der 23S und 16S rRNA sind deutlich erkennbar (Abb. 12C

und E).

Aus den erhaltenen Resultaten wurde geschlossen, dass die Gene sdmA, sdmB und

sdmC auf einem gemeinsamen Messenger liegen, da ihre Sonden in der Northern-

Blot-Analyse jeweils ein Signal in der gleichen Größe zeigten. Unterstützt wird die

Annahme durch die Kartierung des Transkriptionsstartpunkts, so dass der

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