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4 Material und Methoden

4.9.17 Herstellung radioaktiver DNA Sonden

DNA-Fragmente wurden durch Zufallsmarkierung nach Herstellerangaben

(Hexanucleotide Mix, Roche Diagnostics, Mannheim) radioaktiv markiert. Dazu

wurde die zu markierende DNA mittels entsprechender Oligonukleotide amplifiziert

und in den Vektor Topo pCR 2.1 eingefügt. Eine Sequenzierung stellte sicher, ob

tatsächlich das richtige Fragment eingesetzt wurde. Anschließend wurde es mittels

Restriktionsenzymen wieder ausgeschnitten, in einem Agarosegel aufgetrennt,

eluiert und dann zur Markierung eingesetzt. Der Ansatz enthielt 30 ng zu

markierende DNA, 2 µl α[

P]-dATP zu 3000Ci/mol und die übrigen Nukleotide,

dCTP, dGTP, dTTP, zu einer Endkonzentration von je 0,07 mM. Das Gemisch wurde

für 1 h bei 37°C inkubiert und die markierte DNA danach über Gelfiltrationssäulchen

(MobiSpin S-200, Mo Bi Tec, Göttingen) nach Angaben des Herstellers gereinigt.

4.9.18 Southern-Blot-Analyse

4.9.18.1 Southern-Blot

Der Transfer der DNA aus Agarosegelen auf eine positiv geladene Nylonmembran

(Roti

-Nylon plus, Carl Roth, Karlsruhe) erfolgte durch abwärtsgerichteten

alkalischen Transfer nach Sambrook und Russell (2001). Nach Beendigung des

Transfers wurde die DNA durch UV-Strahlung (245 nm, 12 kJ/min, 2 min,

UV Stratalinker 2400, Stratagene, Amsterdam, Niederlande) fixiert.

4.9.18.2 Southern-Hybridisierung

Die Hybridisierung von DNA mit einer radioaktiv markierten Sonde erfolgte nach

Sambrook und Russell (2001) in 0,5 M Na-Phosphat-Puffer, pH 7,2, 7 % SDS,

1 mM EDTA. Nach der Hybridisierung wurde die Membran zweimal für 10 min mit

0,5 M Na-Phosphat-Puffer, pH 7,2, 5 % SDS und zweimal für 10 min mit 0,5 M Na-

Phosphat-Puffer, pH 7,2, 1 % SDS gewaschen. Bei Bedarf wurde die radioaktive

Sonde wieder von der Membran entfernt. Dazu wurde sie für 2 h in einem

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