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4 Material und Methoden

4.9.20 Denaturierende RNA-Agarosegelelektrophorese

RNA wurde in unterschiedlichen Mengen durch denaturierende Agarose-

Formaldehyd-Gelelektrophorese nach Ausubel et al. (1996) in 40 mM MOPS, pH 7,0,

50 mM Na-Acetat, 10 mM EDTA getrennt. Der Ladepuffer bzw. Größenstandard

wurde nach Angaben des Herstellers verwendet (2 x Loading Dye Solution for RNA

electrophoresis bzw. RNA Ladder High Range, ready to use, MBI Fermentas,

St. Leon-Rot).

4.9.21 Northern-Blot-Analyse

4.9.21.1 Northern-Blot

Die Übertragung von RNA aus Agarosegelen auf eine Membran erfolgte durch

abwärtsgerichteten Transfer (Chomczynski, 1992). Hierzu wurde das Agarosegel

15 min schüttelnd in DEPC behandeltes H

O inkubiert und anschließend die RNA

mit 3 M NaCl, 8 mM NaOH auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roti

-Nylon

plus, Carl Roth, Karlsruhe) übertragen. Die RNA wurde danach durch UV-Strahlung

(245 nm, 12 kJ/min, 2 min, UV Stratalinker 2400, Stratagene, Amsterdam,

Niederlande) fixiert und die Membran mit 0,02% (w/v) Methylenblau in 0,3 M Na-

Acetat, pH 5,5 gefärbt. Mit destilliertem H

O wurde diese dann bis zur gewünschten

Kenntlichkeit der RNA entfärbt.

4.9.21.2 Northern-Hybridisierung

Die Hybridisierung von RNA mit einer radioaktiv markierten Sonden erfolgte unter

den Bedingungen einer Southern-Hybridisierung.

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Brak uwag

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