MTD 243-670 Instrukcja Użytkownika Strona 1

Die Demethylierung von Dimethylselenid ist eine adaptive Antwort des Archaeons Methanococcus voltae auf Selenmangel Dissertation zur Erlangung

2 Zusammenfassung 4SdmA, SdmB und SdmC die Erschließung der oben genannten methylierten Substrate erlauben könnten. Versetzt man das Selenmangelmedium

Lebenslauf : Persönliche Daten: Name: Niess Vornamen: Ulf Michael

Erklärung ich versichere, dass ich meine Dissertation Die Demethylierung von Dimethylselenid ist eine adaptive Antwort des Archaeons Methanococcus

3 Einleitung 53 Einleitung Methanogene sind prokaryotische, strikt anaerobe Organismen, die Methan zur Energiegewinnung produzieren. Der Prozess der

3 Einleitung 6ist die membrangebundene Escherichia coli ähnliche Hydrogenase Ech (Künkel et al., 1998; Meuer et al., 1999). Ihre biologische Bedeutumg

3 Einleitung 7Die Methylthiol:Coenzym M-Methyltransferase aus M. barkeri katalysiert beide Reaktionen, die Demethylierung des DMS und die Methylierung

3 Einleitung 8Selen Das Selen gehört der Hauptgruppe VIA des Periodensystems der Elemente an. Es kommt in vier verschiedenen Oxidationsstufen vor: al

3 Einleitung 9Organische Selenverbindungen Außer den anorganischen Selenverbindungen können in der Umwelt auch organische vorgefunden werden. Am häuf

3 Einleitung 10Selen kann bei sehr hohen Konzentrationen in flüchtige organische Selenverbindungen umgewandelt und in die Atmosphäre abgegeben werden.

3 Einleitung 11aufgenommenen, oxidierten Selenverbindungen zu Selenid reduziert werden. Ursprünglich dachte man, dass dies auf dem Weg der Reduktion d

3 Einleitung 12 Selenocystein Selenocystein Lyase Se HSe- AMP+Pi ATPH2SePO3-Selenophosphat Synthetase GS-Se-4 GSH + SeO32- GS-Se-SG GSSG Abb

3 Einleitung 13(Selenocysteine insertion sequence) (Zinoni et al., 1990). Es kommt in der 3‘-nicht-kodierenden Region der mRNA in Eucarya und in Bacte

Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden von März 2001 bis Februar 2004 am Fachbereich Biologie der Philipps-Universität unter der Leitung v

3 Einleitung 14angenommen werden. So werden die selenfreien Hydrogenasen Fru und Vhu, wie die selenfreie Formylmethanofuran-Dehydrogenase aus M. kandl

3 Einleitung 15tetrahydromethanopterin-Dehydrogenase sind ebenfalls an der Methanogenese beteiligt (Thauer, 1993). Ziel der Arbeit Wie oben schon er

4 Material und Methoden 164 Material und Methoden 4.1 Chemikalien Die während dieser Arbeit verwendeten Chemikalien wurden, wenn nicht gesondert an

4 Material und Methoden 17E. coli XL1 Top 10 F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) ф80lacZ∆M15 ∆lacX74 deoR recA1 araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StR) en

4 Material und Methoden 18sdmA p2sonde3´ GGAATGAACAGAGCAGGTGTTATG Sonde I p2sonde5´ AGATAGGACCGCCACCAACC Sonde I m13fwPrimer IRD800b-GTAAAACGACGGCCA

4 Material und Methoden 19RTpac GTGTATGACAAGAAAACCTGGTG RT-PCR pacsondefw GTTTGTAAAGTGGTAGAACAATTTCG Sonde V pacsonderv CCAGGTTTTCTTGTCATACACC Sond

4 Material und Methoden 20pNPAC-sdmC Integrationsvektor für M. voltae mit sdmC flankierenden Sequenzen Diese Arbeit pNPAC-sdmBC Integrationsvektor fü

4 Material und Methoden 21 Spe I 2906 Hind III 2878 pNPAC-sdmA 5686 bp sdmAup sdmAdown Tmcr Npac Psl Mlu I 3497 Nr

4 Material und Methoden 22 Nru I 3447 Mlu I 3454 Spe I 2906 Hind III 2878 sdmCup pNPAC-sdmC 5693 bp sdmCdown Tmcr Npac Nh

4 Material und Methoden 234.8 Mikrobiologische Methoden 4.8.1 Kultivierung von Methanococcus voltae M. voltae wurde unter strikt anaeroben Bedingung

Während der Promotion erzielten Ergebnisse sind in folgendem Artikel veröffentlicht: Niess, U.M. and Klein A. (2004) Dimethylselenide Demethylation

4 Material und Methoden 244.9 Molekularbiologische Methoden 4.9.1 Fällung von DNA/RNA mit Isopropanol Fällung von DNA bzw. RNA mit Isopropanol erf

4 Material und Methoden 254.9.5 Reinigung chromosomaler DNA aus M. voltae Die Reinigung von chromosomaler DNA erfolgte nach Sitzmann und Klein (1991

4 Material und Methoden 264.9.8 Klonierung von PCR-Produkten, Restriktion und Ligation von DNA Die Klonierungen von PCR-Fragmenten erfolgte nach Her

4 Material und Methoden 27gebracht. Davon wurden jeweils 3 µl in vier verschiedene Reaktionsgefäße aliquotiert, zu denen je 1 µl der Sequenzierreagenz

4 Material und Methoden 28(SequaGel XR, Biozym Diagnostik, Hess. Oldendorf) mittels eines automatischen Sequenzierers (LI-COR II 4000S MWG Biotech AG

4 Material und Methoden 294.9.15 Transfektion von M. voltae Die Transfektion von M. voltae erfolgte in anaerober Atmosphäre (5% H2, 20% CO2, 75% N2)

4 Material und Methoden 304.9.17 Herstellung radioaktiver DNA Sonden DNA-Fragmente wurden durch Zufallsmarkierung nach Herstellerangaben (Hexanucleo

4 Material und Methoden 31Hybridisierungsofen bei 90°C in 1 mM Na-Phosphat-Puffer, pH 7,2, 7 %SDS inkubiert und anschließend einmal für 30 min bei 90

4 Material und Methoden 324.9.20 Denaturierende RNA-Agarosegelelektrophorese RNA wurde in unterschiedlichen Mengen durch denaturierende Agarose-Forma

4 Material und Methoden 334.9.22 Herstellen einer partiellen Genbank Die Erstellung einer partiellen Genbank wurde nach Sambrook und Russell (2001)

Inhaltsverzeichnis 1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS_________________________________1 2 ZUSAMMENFASSUNG ______________________________________3 3 EINLEITUNG_

4 Material und Methoden 344.9.23 Screening einer partiellen Genbank durch Koloniehybridisierung Die Koloniehybridisierung wurde nach Sambrook und Ru

4 Material und Methoden 35Zellsuspension wurde in 10 ml Serumflaschen überführt und gasdicht verschlossen. Die Zentrifugation und das Waschen der Zell

5 Ergebnisse 365 Ergebnisse Wie bereits in der Einleitung erwähnt, werden die Gene der Hydrogenasen Vhc und Frc nur bei Selenmangel transkribiert (Be

5 Ergebnisse 37(GLADGMNR) gezeigt, das ebenfalls aus der erwähnten Proteinsequenzierung erhalten wurde. Dieses liegt innerhalb der Aminosäuresequenz,

5 Ergebnisse 38 T E S Q E N M I K Q L M T E S Q E N M I K Q L S D

5 Ergebnisse 39Genbanken durch Koloniehybridisierung identifiziert. Für beide Verfahren wurde die Sonde I verwendet, die an das Gen sdmA bindet. Das F

5 Ergebnisse 40Signal, wodurch eine Wechselwirkung der Sonde mit der Vektorsequenz auszuschließen war. Sonde I 1 bp2000 bp Eco RVEco RV Eco RV 1200 b

5 Ergebnisse 41wurden noch zwei weitere offene Leseraster, sdmB und sdmC, identifiziert. Die komplette Sequenz findet sich in der Genbank unter der Z

5 Ergebnisse 42672 bp1089 bp1098 bp sdmB sdmA sdmC Abb. 7: Relative, chromosomale Anordnung der Gene sdmA, sdmB und sdmC Die jeweiligen Größen der

5 Ergebnisse 43Die Aminosäuresequenzen der Proteine SdmB und SdmC weisen Übereinstimmungen zu Methyltransferasen auf, die, wie oben erwähnt, in der me

4.9.14 Elektrotransformation von E. coli ______________________________ 28 4.9.15 Transfektion von M. voltae ___________________________________ 29 4

5 Ergebnisse 44 MtaA M. acetivosranMtbA M. barker MtaA M. barkeri iSdmB M. voltae SdmC M. voltae MtsA M. barkeriMtaA M. ace

5 Ergebnisse 455.5 Das Gen sdmA wird nur bei Selenmangel transkribiert In der 2D-Elektrophorese wurde gezeigt, dass das Protein SdmA nur bei Selenman

5 Ergebnisse 46 23 23nt 1 1 150010002000300060004000 I sdmC sdmB sdmA 500 A BC nt 56789 56 894 4 7 500 15001000200060004000300

5 Ergebnisse 475.6 Bestimmung eines möglichen Transkriptionsstartpunkts des Gens sdmA Die Gengruppen der Hydrogenasen Vhc und Frc werden, wie in de

5 Ergebnisse 48 A TTTAAAAAATATATTAAAAATAAATTTATTTTAATTAAAGTAGTTC TTAATAGATTTCTTTACATCCTTATTCGATATTATGTTTTCTAATG -23

5 Ergebnisse 495.7 Die Gene sdmA, sdmB und sdmC liegen auf einem gemeinsamen polycistronischen Messenger In der vorangegangenen Northern-Blot-Analyse

5 Ergebnisse 50Messenger bei einer Größe von 3500 nt die Gene sdmA, sdmB und sdmC überdecken würde. In einem weiteren Versuch wurde die Sonde III von

5 Ergebnisse 515.8 M. voltae kann methylierte Amine, Dimethylsulfid oder Methanol nicht für die Methanogenese erschließen In dem vorangegangenen Seq

5 Ergebnisse 52 Methan [nmol] 500 MethanolDMS MMADMA TMAH2 H2CO2 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 05Zeit [min] 10 15 Abb. 13: Gaschromatog

5 Ergebnisse 53dargestellt. Hieraus wird ersichtlich, dass das Gen durch Rekombination zweier homologer Bereiche mit dem Konstrukt ausgetauscht und da

VON DIMETHYLSELENID EINE GERINGERE WACHSTUMSRATE ALS DIE STÄMME V1 UND V1∆SDMB ______________________________________ 59 5.13 DAS GEN SDMC BESITZ

5 Ergebnisse 54beider Gene sdmB und sdmC angenommen. Die Kontrolle der Klone erfolgte über eine Southern-Blot-Analyse. Die Fragmente für die radioakti

5 Ergebnisse 55 2573 bp1258 bpV 2: V1∆sdmAsdmCsdmBpacNAcc IAcc INco IIV IV sdmCsdmBsdmA3237 bpAcc IAcc I21bp 21 1500 1200 4000 3000 2500 2000 1:

5 Ergebnisse 56 3´-sdmC 3´-sdmC 4: V1∆sdmBC3: V1∆sdmC2: V1∆sdmB 1: wt VI VI 1375 bpsdmA sdmA pacN 2521 bpNcoVEcoRIIVEcoRI3341bpsdmC sdmA pacN

5 Ergebnisse 575.11 Die Proteine SdmA und SdmC sind an der Erschließung von Selen aus Dimethylselenid beteiligt Im Abschnitt 5.8 wurde gezeigt, dass

5 Ergebnisse 58das Reportergen bei den Stämmen V1∆sdmA, V1∆sdmC und V1∆sdmBC bereits ab einer DMSe-Konzentration von 10 µM und darunter, bei den Stämm

5 Ergebnisse 59 Selenquelle [µM] β-Glucuronidaseaktivität in Extrakten aus den Stämmen NaSelenit DMSe V1 V1∆sdmAV1∆

5 Ergebnisse 60In früheren Arbeiten wurde unter Selenmangelbedingungen, d.h. bei einer Selenat- bzw. Selenitkonzentration von 1 bzw. 3 nM und darunte

5 Ergebnisse 61 V1∆sdmA + DMSe 10 OD 600 0.1 0 0.01 40 V1 + Se V1 + DMSe V1 - Se 10 1 10 OD 600 0.1 0.01 40 30 20 0 10 V1∆sdmA + Se V1∆s

5 Ergebnisse 62 0.01 0.1 10 1 V1∆sdmBC + Se V1∆sdmBC + DMSeV1∆sdmBC - Se 110OD 600 0.10.01V1∆sdmC + Se V1∆sdmC + DMSe V1∆sdmC - Se 0 10 20

5 Ergebnisse 63in der Wachstumsrate (5.12) wie der Stamm V1 verhielt, so als würde das Gen sdmC exprimiert. Daher lag die Vermutung nahe, dass das Gen

1 Abkürzungsverzeichnis 11 Abkürzungsverzeichnis ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaare dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytidintriphosphat D

5 Ergebnisse 64423 bp RTmetIIfwRTmetIIB RTmetIIr pacN sdmA sdmC bp 98567412 3300700500 A 837 bp RTpac RTmetIrvB RTmetIIB 1000700500300bp 986

6 Diskussion 656 Diskussion In dieser Arbeit wurde das Gen eines Proteins identifiziert, das in Methanococcus voltae nur unter Selenlimitierung synth

6 Diskussion 66Die möglichen Anpassungsmechanismen von M. voltae an Selenmangel Selen kommt in der Umwelt in unterschiedlichen Verbindungen und Konze

6 Diskussion 67um bereits die Synthese der oben genannten selenfreien Hydrogenase zu induzieren. In β-Glucuronidase-Reportergen-Tests unter Verwendung

6 Diskussion 68die Synthese des DMSe nach Selenitzugabe bei M. barkeri beobachtet (Michalke et al., 2000). Wenn das DMSe nun als Selenquelle erschlos

6 Diskussion 69führen auch Deletionen im vorgeschlagenen archaeellen Terminationssignal (Wich et al., 1986) zu einer reduzierten Abbruchseffizienz (Th

6 Diskussion 70Eine andere Möglichkeit wäre eine Induktion aufgrund eines veränderten Redoxstatus der Zelle, da bei Fehlen der selenhaltigen Hydrogena

6 Diskussion 71auch für die an der Bereitstellung des DMSe beteiligten Gene der Proteine SdmA und SdmC gilt, bleibt eine offene Frage. Es ist vorstel

6 Diskussion 72In der Aminosäuresequenz beider Methyltransferasen, SdmB bzw. SdmC, wurde auch ein mögliches Zinkbindemotiv, His239-X-Cys241-XN-Cys322

6 Diskussion 73Wie bereits oben erwähnt, wurde angenommen, dass die Proteine SdmA, SdmB und SdmC an der Demethylierung eines bestimmten Substrats unte

1 Abkürzungsverzeichnis 2nt Nukleotide OD Optische Dichte PCR Polymerasekettenreaktion PNPGluc 4-Nitrophenyl-ß-1,4-Glucuronid Psl Promotor des S-laye

6 Diskussion 74müssten deshalb das Corrinoid-Protein SdmA und die Methyltransferase SdmC beteiligt sein, jedoch nicht SdmB. Bei der Deletion von sdmB

6 Diskussion 75vermutlich die Methyltransferase MttB (Ferguson & Krzycki, 1997). Die Demethylierung des TMA führt zum DMA, das weiter zum MMA deme

6 Diskussion 76Ferner kann vermutet werden, dass die Demethylierung des DMSe zur Bildung des Selenwasserstoffs führen könnte, der dann der Selenophosp

6 Diskussion 77werden. Die Deletionsmutanten V1∆sdmA und V1∆sdmC sollten dann im Gegensatz zum Wildtyp keine markierten Selenoproteine synthetisieren.

7 Literaturverzeichnis 787 Literaturverzeichnis Afting, C., Kremmer, E., Brucker, C., Hochheimer, A. & Thauer, R. K. (2000). Regulation of the sy

7 Literaturverzeichnis 79the intergenic region between the operons encoding selenium-free hydrogenases. Mol Gen Genet 248, 225-228. Berghöfer, Y. &am

7 Literaturverzeichnis 80Burke, S. A. & Krzycki, J. A. (1995). Involvement of the "A" isozyme of methyltransferase II and the 29-kilodal

7 Literaturverzeichnis 81 Dungan, R. S. & Frankenberger, W. T. (2000). Factors affecting the volatilization of dimethylselenide by Enterobacter cl

7 Literaturverzeichnis 82Forchhammer, K. & Bock, A. (1991). Selenocysteine synthase from Escherichia coli. Analysis of the reaction sequence. J Bi

7 Literaturverzeichnis 83Guo, L., Jury, W. A. & Frankenberger, W. T., Jr. (2000). Measurement of the Henry´s Constant of Dimethyl Selenide as a Fu

2 Zusammenfassung 32 Zusammenfassung Im natürlichen Lebensraum von Methanococcus voltae kommt Selen in unterschiedlichen Verbindungen und Konzentrati

7 Literaturverzeichnis 84 Keltjens, J. T. & Vogels, G. D. (1993). Conversion of methanol and methylamines to methane and carbon dioxide. In Methan

7 Literaturverzeichnis 85Leinfelder, W., Zehelein, E., Mandrand-Berthelot, M. A. & Bock, A. (1988). Gene for a novel tRNA species that accepts L-s

7 Literaturverzeichnis 86Moore, M. D. & Kaplan, S. (1992). Identification of intrinsic high-level resistance to rare-earth oxides and oxyanions in

7 Literaturverzeichnis 87Ogasawara, Y., Lacourciere, G. & Stadtman, T. C. (2001). Formation of a selenium-substituted rhodanese by reaction with s

7 Literaturverzeichnis 88 Sandholm, M. & Sipponen, P. (1973). Formation of unstable selenite-glutathione complexes in vitro. Arch Biochem Biophys

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7 Literaturverzeichnis 90Veres, Z., Kim, I. Y., Scholz, T. D. & Stadtman, T. C. (1994). Selenophosphate synthetase. Enzyme properties and catalyti

7 Literaturverzeichnis 91Wilting, R., Schorling, S., Persson, B. C. & Bock, A. (1997). Selenoprotein synthesis in archaea: identification of an mR

7 Literaturverzeichnis 92 Zhou, Z. S., Peariso, K., Penner-Hahn, J. E. & Matthews, R. G. (1999). Identification of the zinc ligands in cobalamin-i

Dank: Herrn Prof. Dr. A. Klein gilt mein besonderer Dank für die Anregung zu dieser Arbeit, seiner Diskussionsbereitschaft und Unterstützung. Prof.