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4 Material und Methoden

(SequaGel XR, Biozym Diagnostik, Hess. Oldendorf) mittels eines automatischen

Sequenzierers (LI-COR II 4000S MWG Biotech AG Ebersberg) aufgetrennt und

analysiert.

4.9.12 RT-PCR

Die RT-PCR wurde nach der Vorschrift des Herstellers durchgeführt (SuperScript

RNase H

Reverse Transcriptase, Invitrogen

life technologies, Karlsruhe). Zur

cDNA komplementäre RNA wurde mit RNase H ebenfalls nach den Angaben des

Protokolls entfernt.

4.9.13 Herstellung elektrokompetenter Zellen aus E. coli

Die Herstellung elektrokompetenter Zellen erfolgte mit dem E. coli-Stamm XL1-Blue

nach Angaben von Sambrook und Russell (2001).

4.9.14 Elektrotransformation von E. coli

Die Elektrotransformation von E. coli wurde nach Sambrook und Russell (2001)

durchgeführt. Dafür wurden elektrokompetente Zellen langsam auf Eis aufgetaut,

50 µl der Zellsuspension mit 10 ng - 25 ng der zu transfizierenden DNA-Lösung

durchmischt und in eine Elektroporationsküvette mit 2 mm Elektrodenabstand

überführt. DNA-Lösungen aus Ligationsansätzen wurden vorher auf einer

Dialysemembran (MF-Millipore

™

Membrane Filters, Porengröße 0,025 µm, Millipore,

Eschborn) gegen Wasser dialysiert. Die Zellen wurden dann mit einem Puls unter

einer Spannung von 2,5 kV, einer Kapazität von 25 µF und einem Widerstand von

200 Ω elektroporiert. Nach erfolgtem Spannungsstoß wurden sie in 1 ml StandardI-

Medium (Merck, Darmstadt) für 30 min inkubiert und anschließend auf

antibiotikahaltigem Festmedium ausplattiert.

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