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3 Methoden

Zur Vorbereitung für die Messung unter Cryo-Bedingungen wurden 3 µL der

Probe (MtrA-H; 0,8 mg/mL in 20 mM MOPS/KOH pH 7,0, 10 mM MgCl2, 0,05 % LM,

1 mM DTT) für 30 s auf ein beglimmtes (ionisiertes) Karbongitter (Quantifoil Micro

Tools, Jena) aufgetragen. Nach Entfernen der überschüssigen Flüssigkeit wurden

diese in flüssigem Ethan (-180 °C) schockgefroren.

3.7.2 Datensammlung und -prozessierung

Das Negativfärbungsverfahren wurde dazu verwendet, die Qualität der

Probenpräparation, z. B. deren Homogenität, zu beurteilen. Die Datensammlung für

die Einzelpartikelmessungen geschah dann unter Cryo-Bedingungen. Die Bilder

wurden mit einem Philips CM120 Elektronenmikroskop (Philips, Hamburg) bei 120 V

und geringer Strahlendosis mit 44 000-facher Vergrößerung auf einem Kodak

SO-163 Electron Emulsion Film (Eastman Kodak Company, Rochester, USA)

aufgenommen, welcher mit einem Kodak D-19 Entwickler (Eastman Kodak

Company, Rochester, USA) für 12 min entwickelt wurde.

Die Negative wurde mittels

eines Zeiss SCAI Scanners (Carl Zeiss, Jena) mit einer Pixelgröße von 7 µm

eingelesen. Benachbarte Pixel wurden gemittelt, sodass die Probe schlussendlich

mit einer Pixelgröße von 3,18 Å erfasst wurde.

3.7.3 Datenanalyse und Rekonstruktion

Zur Auswahl der Partikel wurde das Programmpaket EMAN verwendet (130). Die

CTF (Kontrast-Transfer-Funktion) wurde mit CTFFIND3 berechnet und mit dem

Programm ctfit des EMAN-Programmpakets einberechnet (131). Für die

Rekonstruktion wurden 7380 Einzelpartikel einbezogen. Die Klassensummen für

Abbildung 4.8a wurden mit dem Programm IMAGIC (Image Science Software, Berlin)

erstellt.

1 2 ... 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 ... 143 144

Brak uwag

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