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3 Methoden

Hierbei wurde eine minimale Proteinprobe (ca. 100 µg, maximal 50 µL) auf einer

geeigneten Gelfiltrationssäule (Superdex 200 PC 3.2/30 oder Superose 6 PC 3.2/30,

CV: je 2,6 mL) über 1,2 CV mit einem entsprechenden Puffer bei einer Flussrate von

50 µL/min isokratisch eluiert. Die Detektion erfolgte mittels Messung der UV/Vis-

Absorption bei bis zu drei Wellenlängen. Teilweise wurde darüber hinaus eine

Fraktionierung des Eluats zur weiteren Analyse durchgeführt.

Zur Abschätzung des Molekulargewichts der eluierten Proteine wurde eine

Probenmischung löslicher Standardproteine aufgetragen (Gel Filtration Calibration

Kits LMW und HMW, GE Healthcare, München) und anhand des Elutionsprofils eine

Eichgerade (siehe Anhang, Abschnitt 7.1) erstellt.

3.4.6 Massenspektrometrie

Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS):

Bei dieser Methode wird die flüssige Probe durch eine Kapillare in ein

elektrisches Feld gebracht. Durch elektrostatische Kräfte und die

Oberflächenspannung gelangen die Ionen in die Gasphase und werden

beschleunigt. Am Interface gehen die Ionen vom Atmosphärendruck der

Ionisationskammer zum Hochvakuum des Analysators über. Im Quadrupol-

Analysator erfolgt die Auftrennung der Ionen nach ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis,

sodass ein charakteristisches Spektrum entsteht. Dieses Spektrum wird mit Hilfe des

Programms Mascot mit einer Datenbank verglichen und so das Protein identifiziert.

Die Analyse der Molekularmassen der Peptidfragmente nach einem Trypsin-

Verdau von MJMtrA3 (heterolog exprimiertes des-[225-246]-MtrA aus M. jannaschii)

wurde von der Firma Proteome Factory (Berlin) durchgeführt. Dazu wurden die zu

untersuchenden Banden aus einem 15 %-igen SDS-Polyacrylamidgel

ausgeschnitten und eingeschickt.

Der gereinigte Mtr-Komplex mit Untereinheit MtrH (MtrA-H) sowie der ohne

Untereinheit MtrH gereinigte Komplex MtrA-G wurden in einem 15 %-igen SDS-Gel

in ihre Untereinheiten aufgetrennt. Die entsprechenden Banden wurden

ausgeschnitten und einem Trypsin-Verdau unterzogen. Dazu wurde das

ProteoExtract

All-in-One Trypsin Digestion Kit (Calbiochem, Darmstadt) nach

Vorschrift verwendet. Die verdauten Proben wurden von Herrn Dr. Julian Langer am

Max-Planck-Institut für Biophysik in Frankfurt mittels ESI-MS analysiert.

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