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5 Diskussion

Konfiguration gebunden wird (55, 143). Anders als andere Cob(I)amid- und

Cob(II)amid in base-off/His-on-Konfiguration bindende Enzyme, deren

Kristallstrukturen zum Teil bereits vorliegen, besitzt MtrA jedoch nicht die Konsensus-

Sequenz (DXHXXG - 41-42 AS – SXL - 21-22 AS - GG) (144-148). Die genaue

Strukturbestimmung des MtrA-Holoproteins bleibt also nicht nur im Hinblick auf die in

Abhängigkeit von der Oxidationsstufe des gebunden Cobalamin zu erwartenden

Konformationsänderungen interessant.

Zur röntgenographischen Strukturbestimmung von MJMtrA3 wurden

umfangreiche Kristallisationsversuche unternommen. Zuerst wurden kommerziell

erhältlichen Screens verwendet, wobei jedoch auffiel, dass MJMtrA3 auch nach

Wochen bei nur sehr wenigen Bedingungen präzipitierte. Deshalb wurden die

Proteinpufferlösung, Proteinkonzentration und Lagerungstemperatur der

Kristallisationsansätze variiert. Da sich auch durch diese Maßnahmen keine

Kristallisation herbeiführen ließ, wurden zwei eigene Screens mit je 96 Bedingungen

entwickelt.

Bei der Kristallisation wird die Löslichkeit des Proteins durch Zugabe von

Fällungsmittel stetig verringert, bis die Sättigungsgrenze überschritten und ein

metastabiler Zustand erreicht ist. In diesem Zustand ist die Kristallbildung, jedoch

keine Keimbildung möglich. Bei weiter steigender Fällungsmittelkonzentration geht

das System in einen labilen Zustand über, in dem Keimbildung und -wachstum

möglich werden. Idealerweise findet die Kristallisation im Grenzbereich zwischen

metastabilem und labilem Zustand statt (149). Als Fällungsmittel werden im

allgemeinen Salze, wasserlösliche Polymere und organische Lösungsmittel

verwendet, die mit dem Protein um die Lösungsmittelmoleküle konkurrieren. Daher

wurden bei den selbst entwickelten Screens zum einen zwei Salze (Na/K-Tartrat und

Ammoniumsulfat), zum anderen Ammoniumsulfat und Glycerin jeweils in

unterschiedlicher Konzentration kombiniert. Doch auch dadurch ließ sich die äußerst

gute Löslichkeit von MJMtrA3 nicht stark genug verringern, um eine Kristallbildung zu

erreichen. Bedenkt man, dass M. jannaschii, der Ursprungsorganismus von

MJMtrA3, ein extremophiles Archaeon ist, erscheint diese Eigenschaft jedoch nicht

verwunderlich.

5.2.3 Des-[238-252]-MtrA (MKMtrA) aus M. kandleri

Die Produktion von des-[238-252]-MtrA (MKMtrA) aus M. kandleri gelang in

E. coli zumindest teilweise als lösliches Protein. Wie SDS-Page und Western Blot mit

Anti-StrepII-Antikörpern jedoch zeigten, betrug das apparente Molekulargewicht von

MKMtrA ca. 16,5 kDa, wogegen sich der anhand der Aminosäuresequenz

1 2 ... 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 ... 143 144

Brak uwag

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